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Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 508 (2023) Citar este artículo

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El virus adenoasociado (AAV) es un vector potente para la transducción de genes in vivo y se esperan aplicaciones terapéuticas locales de los AAV, como para las úlceras cutáneas. La localización de la expresión génica es importante para la seguridad y eficacia de las terapias genéticas. Presumimos que la expresión génica podría localizarse mediante el diseño de biomateriales utilizando poli(etilenglicol) (PEG) como vehículo. Aquí mostramos uno de los portadores de PEG diseñados que localizó efectivamente la expresión génica en la superficie de la úlcera y redujo los efectos fuera del objetivo en la capa profunda de la piel y el hígado, como un órgano representativo para evaluar los efectos fuera del objetivo distantes, utilizando un modelo de úlcera de piel de ratón. . La dinámica de disolución dio como resultado la localización de la transducción del gen AAV. El portador de PEG diseñado puede ser útil para terapias génicas in vivo que utilizan AAV, especialmente para la expresión localizada.

Los virus adenoasociados (AAV) son poderosos vectores para la transducción de genes in vivo. Los AAV se usan clínicamente como terapias de reemplazo para tratar afecciones como la deficiencia de lipoproteína lipasa, la atrofia muscular espinal, la distrofia retiniana y la hemofilia1. Recientemente, las posibles aplicaciones de las AAV se han ampliado para incluir morbilidades localizadas2.

Como resultado de las mejoras en la fabricación, las dosis promedio de AAV utilizadas en los ensayos clínicos están aumentando. Esto permite el uso de dosis más altas que dan como resultado fenotipos más fuertes; sin embargo, la mayoría de los vectores AAV terminan en el hígado y pueden causar toxicidad allí y en otros lugares3. Por lo tanto, controlar la especificidad de la expresión génica, minimizando los efectos fuera del objetivo, es muy importante en el desarrollo de terapias que utilizan AVV. Hasta la fecha, la especificidad ha sido controlada por la selección y la ingeniería del tropismo de tejido/célula de la cápside de AAV4, el uso de promotores específicos de tejido5,6 y la vía de administración3.

Las heridas que no cicatrizan, como las heridas resultantes de úlceras por presión, úlceras diabéticas o insuficiencia vascular periférica, son motivo de preocupación en sociedades con poblaciones que envejecen progresivamente, y se espera que la transferencia génica in vivo basada en AAV sea una modalidad terapéutica útil7,8. Recientemente, demostramos que la inducción in vivo mediada por AAV de la reprogramación de células mesenquimales residentes en heridas hacia células epiteliales permitió la epitelización de novo de la superficie de las úlceras. Estos resultados constituyeron una prueba inicial de principio para el desarrollo futuro de terapias innovadoras9,10.

En la búsqueda de métodos clínicamente aplicables que puedan mejorar la seguridad de la transferencia de genes mediada por AAV en la superficie de las úlceras cutáneas, investigamos el desarrollo de materiales para la liberación controlada de AAV en la superficie de las úlceras11, utilizando poli(etilenglicol) ( PEG) como portador. El PEG, que se usa ampliamente en biomateriales debido a su naturaleza bioinerte, funciona como transportador al encapsular o inmovilizar un fármaco o virus en vesículas e hidrogeles12,13. Los sistemas de hidrogel inyectables que se pueden administrar de forma mínimamente invasiva en un sitio deseado han recibido una atención cada vez mayor para la administración controlada de virus debido a su capacidad para cambiar de una matriz altamente viscosa a un líquido de baja viscosidad14,15. Sin embargo, la inyección de hidrogeles líquidos de baja viscosidad puede causar la difusión del virus encapsulado, es decir, una rápida liberación del sitio de inyección, lo que potencialmente perjudica el tratamiento de infecciones virales localizadas.

Presumimos que un AAV encapsulado en un portador de PEG con una degradabilidad adecuada sufriría una liberación localizada en la superficie de las úlceras cutáneas. Diseñamos un portador de PEG que consiste en una red de polímero reticulado dinámicamente (en lo sucesivo, limo de PEG) que mejoró la especificidad de la transducción de genes en la superficie de las úlceras con efectos fuera del objetivo locales o distantes reducidos. El uso de limo de PEG altamente viscoso demuestra un nuevo método para la transducción de genes altamente localizados.

Preparamos tres tipos de matrices de PEG como posibles portadores de AAV con diferentes entrecruzamientos y tamaños de poro. Todos los PEG estaban formados por protocolos similares; es decir, disolviendo PEG tetrafuncionales mutuamente reticulables y mezclando volúmenes iguales de las mismas concentraciones de los precursores de PEG (Fig. 1a). (1) Hidrogel de PEG16 (Fig. 1b): un hidrogel sintético que actúa como una matriz extracelular artificial se formó mediante la reticulación de PEG de tetrabrazo terminado en propilamina (tetra-PEG-PA) y PEG de tetrabrazo terminado en succinimidilglutarato ( tetra-PEG-GS) a través de enlaces amida, y los enlaces éster en tetra-PEG-GS permitieron que el hidrogel fuera hidrolizable. (2) Esponja de PEG17 (Fig. 1c): un hidrogel de PEG poroso en el que se logró una estructura de fase separada mediante la adición de sulfato de potasio a las soluciones precursoras. (3) PEG slime18 (Fig. 1d): un líquido de polímero viscoelástico preparado mezclando D(+)-glucono-1,5-lactone-terminado tetra-armed PEG (tetra-PEG-GDL) y 4-carboxi-3- PEG con tetrabrazo terminado con ácido fluorofenilborónico (tetra-PEG-FPBA) para formar un entrecruzamiento reversible y fluctuante a través de enlaces éster cíclicos.

una ilustración esquemática que muestra el proceso in situ para la administración de AAV a la superficie de una úlcera cutánea utilizando portadores de PEG. Los tetra-PEG, que se funcionalizaron con grupos mutuamente reticulables y se disolvieron con AAV que contenía PB, se mezclaron en volúmenes iguales, lo que dio como resultado la formación de portadores de PEG que encapsulaban el AAV. Los portadores de PEG preparados se administraron a la superficie de las úlceras cutáneas en el lomo de los ratones, y el AAV se difundió mediante la disolución de los portadores de PEG. b–d Preparación de portadores de PEG. Hidrogel de PEG (b) preparado con tetra-PEG-PA y tetra-PEG-GS, esponja de PEG (c) preparada con los mismos precursores que el hidrogel de PEG, excepto que se añadió sulfato de potasio en PB para crear una estructura de fase separada. Se preparó limo PEG (d) a partir de tetra-PEG-GDL y tetra-PEG-FPBA para obtener un sistema reticulado dinámico. e Fotografías del hidrogel de PEG, la esponja de PEG y la baba de PEG que muestran el comportamiento viscoelástico al agarrarlo. Las barras de escala representan 5 mm. f Módulo de Young (E) en función del tiempo (t) del hidrogel de PEG (triángulos morados), esponja de PEG (rombos naranjas) y limo de PEG (cuadrados azules). E(t) fue normalizado por E a los 0 s [E(0)]. g Fotografías e imágenes de microscopio de barrido láser confocal de portadores de PEG en el estado en que se prepararon. Las barras de escala representan 100 µm.

A pesar de las similitudes en los protocolos sintéticos, estos portadores de PEG tenían estructuras y características distintas. La diferencia en las propiedades mecánicas se observó macroscópicamente bajo compresión: el hidrogel y la esponja de PEG mostraron una deformación completamente elástica, mientras que el limo de PEG mostró una pérdida gradual de la forma original con el tiempo. En observaciones generales, un limo de PEG preparado en forma esférica podría mantener la forma cuando se sujeta con pinzas, similar a un hidrogel poco después de agarrar. Sin embargo, la baba agarrada cayó más tarde como un líquido altamente viscoso de las pinzas y finalmente se convirtió en una forma plana sobre la mesa (Fig. 1e). Luego, la diferencia se cuantificó mediante la prueba de relajación de la tensión, que observa la dependencia del tiempo del módulo de Young [E(t)] después de imponer una compresión al portador. Con la evolución del tiempo, el valor de E (t) disminuyó drásticamente para el limo de PEG, disminuyó ligeramente para la esponja de PEG debido a la extracción de agua y fue constante para el hidrogel de PEG (Fig. 1f). Las mediciones de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) (Fig. 1 complementaria) mostraron que se recuperó la intensidad de fluorescencia del limo de PEG, lo que indica que la relajación del estrés se originó en los enlaces covalentes dinámicos entre GDL y FPBA. La intensidad de fluorescencia del limo de PEG se recuperó por completo ~ 60 s después del fotoblanqueo, mientras que la del hidrogel de PEG no cambió. Esto confirmó el movimiento de traducción de las moléculas constitutivas de la baba de PEG y los enlaces cruzados dinámicos entre estas moléculas. Las observaciones microscópicas de los portadores de PEG preparados con precursores de PEG marcados con fluorescencia roja (la fracción terminal de los precursores de PEG se modificó parcialmente con tinte fluorescente rojo como se describió anteriormente17) indicaron diferencias estructurales entre los portadores. En la esponja PEG, se observó una estructura de isla marina donde las cavidades negras se dispersaron en la imagen, con tamaños de poro del orden de magnitud de 10 µm. En el hidrogel y el limo de PEG, no se observó una estructura característica, lo que sugiere que el tamaño de la red era del orden de magnitud de nm (Fig. 1g). La separación de fases se indujo mediante la adición de una sal inorgánica, que disminuyó la solubilidad del PEG, dando como resultado un hidrogel opaco. Durante el proceso de gelificación, los precursores de PEG se conectan entre sí, aumentando el peso molecular, lo que impulsa la separación de fases17. La concentración de sal fue seleccionada para inducir la separación de fases durante la gelificación y no en las soluciones precursoras originales17.

Para investigar en detalle las diferencias en las características físicas de los portadores de PEG, realizamos análisis comparativos in vitro. Se diseñó un modelo experimental para facilitar la comprensión de la cinética de disolución. Se prepararon portadores de PEG marcados con fluorescencia roja en insertos de cultivo con un tamaño de poro de 8,0 µm (es decir, podían pasar materiales más pequeños) (Fig. 2a). Para la evaluación detallada de los limos de PEG, preparamos un limo de PEG que fue diseñado para disolverse más rápido en comparación con el limo de PEG estándar (denominado limo blando de PEG). La tasa de disolución, calculada midiendo la intensidad de la fluorescencia de las muestras eluidas que pasaron a través del inserto a intervalos de tiempo predeterminados, se incrementó gradualmente para cada armazón, y las tasas de disolución a las 24 h (Dmuestra) fueron Dhidrogel = 19 %, Desponja = 16 % , Dslime = 86% y Dsoft-slime = 90% (Fig. 2b). Además, encapsulamos nanopartículas de sílice de fluorescencia con un diámetro de 30 nm como materiales modelo de diámetro similar a los AAV e investigamos el perfil de liberación de las nanopartículas de sílice de fluorescencia de los portadores de PEG. El comportamiento de liberación de las partículas encapsuladas en cada portador mostró una tendencia similar a la del comportamiento de disolución, y las tasas de liberación a las 24 h (Rmuestra) fueron Rhidrogel = 38 %, Responja = 33 %, Rslime = 75 % y Rsoft- limo = 92%, lo que indica que la liberación de las nanopartículas se rige por la disolución de los portadores (Fig. 2b). Un gráfico de la tasa de disolución frente a la tasa de liberación (Fig. 2c) fue lineal para los lodos de PEG. Esta fuerte correlación demostró que la liberación de las partículas estuvo regida por la disolución de los lodos de PEG. Este resultado indicó que los lodos de PEG eran pseudosólidos, donde la difusión de las partículas estaba muy limitada, pero las cargas podían eluirse a la solución desde la forma líquida.

a Ilustración esquemática que muestra la evaluación de la disolución in vitro. Las fotografías muestran la vista superior del inserto. Las barras de escala representan 5 mm. b Evaluación temporal de la tasa de disolución (símbolos abiertos) y liberación (símbolos cerrados) para hidrogel de PEG (triángulos morados), esponja de PEG (diamantes naranjas), limo de PEG (cuadrados azules) y limo blando de PEG (círculos rojos) preparados en un inserto de cultivo colocado en una placa de cultivo. c Relación de la tasa de disolución y la tasa de liberación.

En particular, las tasas de liberación de los lodos de PEG fueron casi constantes durante 7 h; es decir, se lograron cinéticas de liberación de orden cero ideales. Este resultado se debió a que la elución, que rige la liberación de partículas, se aproximó como de orden cero, ya que solo se produjo a través de la membrana. Por el contrario, la liberación de las partículas del hidrogel de PEG y la esponja no se correlacionó con una región de alta tasa de liberación. Este resultado se debió a que estos portadores eran sólidos y las partículas se liberaron principalmente por difusión.

Para la terapéutica de heridas, se prefieren los métodos de transducción de genes que son altamente específicos para la superficie de las úlceras. Para investigar los efectos de los portadores de PEG en la transducción de genes con un AAV para el tratamiento de úlceras cutáneas, se emplearon úlceras cutáneas aisladas que simulaban la porción central de una úlcera cutánea grande10. Quitamos quirúrgicamente la piel de la parte posterior de los ratones para generar una úlcera y aislamos la herida resultante de la piel circundante utilizando una cámara de silicona suturada a la fascia profunda19,20 (Fig. 2a complementaria). Al aislar la herida de la piel circundante con la cámara, podemos estudiar fenómenos en la superficie de la úlcera sin interferencia de la piel circundante, como la epitelización y la contracción de la herida. GFPNLS-AAVDJ [un tipo de AAV optimizado para células en úlceras cutáneas10 que codifica proteína verde fluorescente (GFP) con una señal de localización nuclear (NLS)] se mezcló con los portadores de PEG y se inoculó en la úlcera. Empleamos el número de células positivas en lugar del percentil porque consideramos que el primero sería más apropiado para análisis histológicos de tejidos de úlceras cutáneas, que consistían en tipos heterogéneos de células con márgenes indefinidos. Probamos diferentes títulos del virus en PBS (Fig. 2b complementaria) y observamos la superficie de la úlcera con un microscopio de fluorescencia a lo largo del tiempo (hasta el día 13) (Fig. 2c complementaria) y las úlceras 72 h después de la administración de 1010 copias del gen ( GC) de virus fueron seleccionados para análisis cuantitativo (Fig. 3a). Las observaciones de las superficies de las úlceras con un estereoscopio fluorescente indicaron que las células positivas para GFPNLS se observaron con mayor frecuencia en animales tratados con AAV encapsulados en baba de PEG, baba blanda de PEG o solución salina tamponada con fosfato (PBS) que en animales tratados con hidrogel de PEG o esponja de PEG. (Fig. 3b, c).

a Administración de GFPNLS-AAVDJ (serotipo AAV-DJ, 1 × 1010 GC por ratón) encapsulado en portadores de PEG en una superficie sin procesar creada en una cámara de silicio de 1 cm de diámetro adherida a la espalda de los ratones. b Células positivas para GFP representativas en úlceras de la piel de la espalda de ratones 72 h después de la administración, observadas bajo un microscopio estereoscópico. Barra = 2 mm. c Números de células positivas para GFP expresadas superficialmente, 72 h después de la administración de cada vehículo que contiene AAV. El diagrama de puntos superpuesto indica la distribución de los datos. Se observó un número significativamente mayor de células positivas para GFP superficiales con baba de PEG o baba blanda, en comparación con los otros portadores de PEG. No se detectaron diferencias significativas entre la baba de PEG o la baba blanda y PBS. * < 0,05, ** < 0,01 (n = 3). d Rebanadas representativas que muestran la infección por AAV-GFPNLS 72 h después de la administración, de formulaciones de limo PEG y PBS. Se observaron muchas células positivas para GFP en la capa profunda cuando se administró AAV-GFPNLS con PBS, mientras que la mayoría de las células positivas para GFP se encontraron en la capa superficial después de la administración con limo de PEG. Las líneas punteadas indican el margen entre las capas superficial y profunda. Barra = 500 µm. e Número de células positivas para GFP en la capa superficial (sobre el tejido subcutáneo) y la capa profunda (hasta el tejido muscular) en cada animal. El diagrama de puntos superpuesto indica la distribución de los datos. Tenga en cuenta que el limo de PEG previno significativamente la infección de tejido profundo, pero no hubo diferencias significativas entre las formulaciones en el número de células positivas para GFP en la capa superficial. * < 0,05 (n = 5).

Mientras que el hidrogel de PEG y la encapsulación de esponja de PEG redujeron la eficiencia de transducción de genes en la superficie de las úlceras cutáneas, la encapsulación de limo de PEG retuvo la eficiencia de transducción original observada con PBS. Los lodos de PEG se usaron para una evaluación histológica adicional con énfasis en la especificidad de la transducción génica en la capa superficial de las úlceras cutáneas. Las úlceras tratadas con GFPNLS-AAVDJ formuladas con limo de PEG, limo blando de PEG y PBS se prepararon y analizaron histológicamente para determinar el número de células positivas para GFPNLS en las capas superficial (granulación y tejido adiposo) y profunda (fascia y músculo) (Fig. 3d y Fig. 2a complementaria). De acuerdo con los resultados de la evaluación estereoscópica, no se encontraron diferencias significativas en el número de células positivas en las capas superficiales de los animales tratados con baba de PEG, baba blanda de PEG o PBS. Por el contrario, el número de células positivas para GFPNLS en las capas profundas disminuyó significativamente en los animales tratados con baba de PEG, en comparación con los ratones tratados con PBS, y el grado de reducción fue mayor en los animales tratados con baba de PEG, en comparación con los animales tratados con baba de PEG. ratones tratados con limo blando (Fig. 3e). Para investigar más a fondo las posibles diferencias en la eficiencia de la transducción de genes en términos de la multiplicidad de la transducción de genes, se administraron mezclas de dos AAV de colores fluorescentes diferentes (GFPNLS-AAVDJ y mCherryNLS-AAVDJ) en la superficie de la úlcera, y la frecuencia de genes duplicados. se midió la transducción (Fig. 3a complementaria). El número de transducción de genes duplicados fue consistente entre PBS y limo de PEG, lo que indica además que no hubo diferencias significativas en los ratones tratados con limo de PEG y PBS en términos de la multiplicidad de transducción de genes (Fig. 3b complementaria). Debido a que el uso de un portador de limo PEG mejoró la eficiencia local específica de la capa de la transducción de genes, en comparación con los otros portadores, investigamos más a fondo los efectos distantes fuera del objetivo de este portador.

El tropismo de las células AAV difiere entre los serotipos y, por lo tanto, la importancia de cada órgano como el objetivo distante depende del serotipo. Anteriormente, evaluamos la distribución de AAVDJ en varios tejidos de órganos después de la inyección de luciferasa-AAVDJ y descubrimos que la expresión de luciferasa se limita principalmente al hígado10. Para investigar la posible influencia de la encapsulación de baba de PEG, se evaluó la expresión de GFPNLS fuera del objetivo en el hígado 28 días después de la inoculación de las úlceras con el vector AAVDJ en un portador de baba de PEG, o PBS, en una cámara cutánea. Se observó una pequeña cantidad de células positivas para GFPNLS en la superficie del hígado usando un estereoscopio (Fig. 4a). La comparación cuantitativa usando qPCR de los títulos de AAV en el hígado indicó que las copias genómicas se redujeron significativamente con el uso del portador de limo PEG, en comparación con PBS (Fig. 4b). Por lo tanto, el uso de un portador de limo PEG tiene el potencial de reducir los efectos distantes fuera del objetivo.

Se administró un GFPNLS-AAVDJ (serotipo AAV-DJ, 5 × 1010 GC por ratón) encapsulado en limo de PEG o diluido con PBS a una superficie sin procesar creada en la espalda de los ratones. Después de 4 semanas, se recolectó el hígado para un análisis cuantitativo, incluidas las evaluaciones de qPCR. No había suficientes células positivas para GFP para el análisis estadístico. La cabeza de la flecha llena indica una célula positiva para GFP observada en el hígado usando un estereoscopio. Barra blanca y negra = 5 mm, barra roja = 500 µm. b Se extrajo ADN genómico de seis lóbulos de cada hígado recolectado para evaluar las tasas de infección por AAV. Los títulos de AAV se redujeron significativamente en el grupo de limo. (n = 7) * <0,05.

A través de una serie de experimentos in vivo, se descubrió que los limos de PEG eran portadores útiles para la transducción de genes AAV específicos de la superficie, mientras que los portadores de esponja de PEG y de hidrogel de PEG reducían la eficiencia de la transducción de genes, en comparación con PBS. Creemos que estas diferencias estaban relacionadas con los perfiles de liberación de los lodos de PEG determinados en las evaluaciones in vitro descritas anteriormente. Para dilucidar las posibles propiedades mecánicas específicas del limo de PEG, se rastrearon los AAV21,22,23 marcados con fluorescencia y descubrimos que la detección confiable era difícil debido a las débiles señales de fluorescencia en relación con las señales de fondo (Fig. 4a-c complementaria). En cambio, se investigó el comportamiento de las nanopartículas de sílice en la superficie de las úlceras cutáneas. En el ensayo inicial, se inocularon nanopartículas de sílice verde fluorescente (con un diámetro de 30 nm, similar al de AAVs24) en PBS. Las nanopartículas se localizaron en la capa superficial al principio y luego se difundieron en las capas profundas, como los tejidos adiposo y muscular, con el tiempo. Es importante destacar que solo quedaron unas pocas partículas en la superficie de la úlcera a las 24 h (Fig. 5 complementaria). En consecuencia, se utilizaron 24 h como marco de tiempo experimental para el siguiente análisis cuantitativo de la influencia del portador de PEG en la disolución de PEG y la liberación de las nanopartículas de sílice.

Las nanopartículas de sílice verde fluorescente se mezclaron con portadores de PEG o PBS y luego se inocularon en una úlcera (Fig. 5a). Con los portadores de PEG, quedaron más nanopartículas de sílice en la capa superficial a las 24 h, en comparación con PBS. Este efecto fue mayor para el limo de PEG y el limo blando de PEG que con el hidrogel de PEG y la esponja de PEG (Fig. 5b, c). La distribución prolongada específica de la superficie de las nanopartículas de sílice utilizando un portador de limo PEG podría estar asociada con la transducción del gen AAV específico de la superficie.

a Administración de nanopartículas de sílice fluorescente encapsuladas en portadores de PEG a la superficie sin procesar creada en la espalda de los ratones. Se inyectaron portadores de hidrogel y esponja de PEG en la cámara, mientras que se insertó limo de PEG ya que no se podía inyectar el limo. El techo de la cámara de silicio establecida se abrió para observación 24 h después de la administración. b Comparación de la difusión de partículas de los portadores de PEG, 24 h después de la administración. Imágenes representativas de un estereoscopio y cortes. Tenga en cuenta que las partículas administradas con limo de PEG se concentraron en la superficie de la úlcera, mientras que las partículas se difundieron en los músculos cuando se administraron con PBS. Barra = 1 mm. c El número de nanopartículas de sílice fluorescente en la capa superficial. El diagrama de puntos superpuesto indica la distribución de los datos. Con limo PEG y limo blando, la cantidad de nanopartículas fluorescentes en la capa superficial aumentó significativamente. (n = 3) * <0,05, ** <0,01, *** <0,001.

Con la baba de PEG, aumentó el número de nanopartículas de sílice en la capa superficial, aunque no aumentó la transducción de genes mediada por AAV en la capa superficial. Consideramos que esta discrepancia podría deberse a la descomposición de los AAV en PEG con el tiempo.

Para determinar los posibles efectos del tiempo de almacenamiento a temperatura corporal y solución solvente en la capacidad de transducción de genes de los AAV, probamos la capacidad de transducción de genes de los AAV mantenidos durante 0, 3, 6, 12, 18 y 24 h a 37 °C con o sin suero de sangre de ratón in vitro (Fig. 6a). Cuando los AAV se mantuvieron a 37 °C durante 3 a 18 h en ausencia de suero, la capacidad de transducción de genes de los AAV se redujo gradualmente a una décima parte de la capacidad original. Por el contrario, cuando los AAV se mantuvieron durante 24 h con suero, se mantuvo la capacidad de transducción de genes de los AAV (Fig. 6b). La capacidad de transducción de genes de los AAV dentro de la baba de PEG, formulada con PEG y PBS, podría reducirse con el tiempo, mientras que esta reducción podría atenuarse una vez que se liberaran los AAV de la baba de PEG. Con el tiempo, la descomposición de los AAV en PEG podría contribuir a la discrepancia en el comportamiento de las nanopartículas de sílice y la eficiencia de transducción de genes en la capa superficial.

Se probó la eficiencia de transducción génica de GFPNLS-AAVDJ mantenida durante 0, 3, 6, 12, 18 y 24 h a 37 °C con o sin suero sanguíneo de ratón en células estromales derivadas de tejido adiposo de ratón (mASC) in vitro. b La capacidad de transducción de genes de GFPNL-AAV se redujo gradualmente después del almacenamiento a 37 °C en ausencia de suero, mientras que fue consistente después del almacenamiento durante 24 h con suero. El diagrama de puntos superpuesto indica la distribución de los datos. (n = 4).

En el presente estudio, se evaluó una variedad de portadores de PEG utilizando un modelo de úlcera cutánea in vivo. El limo de PEG localizó con éxito la expresión génica en la superficie de la úlcera, con una reducción significativa en la expresión génica tanto en la capa muscular profunda como en el hígado, en comparación con los otros portadores investigados.

Para investigar la cinética detallada de los AAV, se utilizó el marcado fluorescente. Sin embargo, el rastreo confiable fue difícil debido a las débiles señales de fluorescencia en relación con las señales de fondo. Alternativamente, empleamos nanopartículas de sílice porque cada partícula exhibió una fuerte fluorescencia y se pudo rastrear de manera confiable en muestras de tejido de úlceras cutáneas. La posibilidad de que las nanopartículas de sílice y AAV no muestren el mismo comportamiento es una limitación fundamental del estudio actual.

La eficiencia de transducción génica in vivo difirió entre los diferentes portadores de PEG. Esta diferencia se atribuyó a los mecanismos de disolución resultantes de las diferentes formas de entrecruzamiento. En los hidrogeles y esponjas de PEG, todas las moléculas estaban conectadas a través de enlaces irreversibles. Así, estos portadores tenían propiedades características de los sólidos; la caracterización in vitro mostró que exhibieron un módulo elástico finito bajo tensión constante (Fig. 1f). La evaluación in vitro de las tasas de disolución de PEG y las tasas de liberación de partículas mostró que hubo una reducción significativa en ambas tasas cuando se usaron hidrogeles y esponjas, en comparación con los otros portadores, lo que sugirió que las nanopartículas quedaron atrapadas en las redes (Fig. 2b) .

En general, se considera que los materiales poliméricos sólidos, como los hidrogeles de PEG y las esponjas, se degradan de manera homogénea, lo que se denomina degradación masiva, en lugar de degradarse gradualmente desde la superficie25,26,27. En otras palabras, la escisión de la cadena ocurre homogéneamente con el tiempo por hidrólisis. Eventualmente, cuando la conectividad de la red cae por debajo de cierto nivel, los hidrogeles y esponjas de PEG pasan de un estado sólido a líquido. Por lo tanto, se cree que los hidrogeles y esponjas de PEG tienen una liberación de partículas reducida, en comparación con los otros portadores, porque penetran en los tejidos con partículas de AAV atrapadas mientras se degradan (Fig. 7a). Los experimentos con partículas fluorescentes para evaluar el movimiento físico de las nanopartículas mostraron que tanto los hidrogeles como las esponjas dieron como resultado una cantidad reducida de partículas en la capa superficial de las úlceras (Fig. 5b, c), en comparación con los limos de PEG.

Se prepararon portadores de esponja o hidrogel de PEG que encapsulaban los AAV mezclando precursores gelificantes de tetra-PEG con grupos succinimidilglutarato (tetra-PEG-GS) y propilamina (tetra-PEG-PA) en los extremos, que se entrecruzaron mutuamente por condensación para formar amida enlaces, que son lazos irreversibles. Los grupos éster introducidos originalmente en tetra-PEG-GA se introdujeron entre las moléculas de PEG, que finalmente se hidrolizan para degradar el hidrogel o la esponja. El proceso de degradación puede proceder de manera homogénea en estos soportes, lo que se denomina degradación a granel, en lugar de que la degradación proceda gradualmente desde la superficie. A medida que se degradan los transportadores, los AAV encapsulados se difunden a las capas superficiales o profundas e infectan las células circundantes. b El lodo de PEG se preparó mezclando soluciones acuosas de tetra-PEG terminados en ácido borónico o diol (tetra-PEG-GDL y tetra-PEG FPBA), que se entrecruzaron mutuamente mediante una reacción de éster cíclico para formar enlaces de coordinación, que son reversibles. cautiverio. El entrecruzamiento reversible dotó a la matriz de PEG de una propiedad altamente viscoelástica, haciendo que la matriz fuera líquida. Este líquido PEG podría variar en forma para cubrir una úlcera cutánea y encapsular AAV sin difundirse a través de las capas de la piel. La baba de PEG se difunde hacia la capa superficial, en lugar de degradarse, desde la interfaz entre la baba y la úlcera cutánea. Como la baba de PEG puede penetrar en la capa superficial, la baba de PEG se hincha y se diluye, lo que provoca una infección en las células circundantes, lo que da como resultado una reducción de la expresión génica distante fuera del objetivo en el hígado. c AAV administrado con PBS se difundió rápidamente. La potencia de transducción de genes no se daña hasta que AAV alcanza capas profundas. Por lo tanto, AAV infecta efectivamente tanto las capas superficiales como las profundas.

Las partículas de AAV requieren contacto directo con las células para una infección exitosa por endocitosis6. Por lo tanto, la infección por AAV se suprimió cuando las partículas de AAV quedaron atrapadas en una red de PEG porque no había contacto directo con las células. En otras palabras, las partículas de AAV no liberadas no son infecciosas, lo que resultó en una disminución de la expresión de GFP en la superficie de la úlcera después de la administración de AAV usando un hidrogel o una esponja de PEG.

Por el contrario, las moléculas se conectaron a través de enlaces reversibles en el limo de PEG, lo que resultó en un equilibrio entre la unión y la disociación de las moléculas (Fig. 1 complementaria). El módulo elástico de la baba disminuyó y llegó a cero con el tiempo (Fig. 1f), lo que indica que la baba era un líquido desde el punto de vista termodinámico. Por lo tanto, la baba de PEG aplicada a la superficie de la úlcera podría difundirse como un líquido y penetrar desde la superficie de la úlcera hacia los tejidos profundos; El limo de PEG y el PBS se consideraron equivalentes en términos de difusión del portador y AAV.

El limo de PEG mostró características notables que diferían del PBS. Tanto las tasas de disolución como de liberación del limo fueron más bajas que las de los que usaron PBS (Fig. 2b), y las tasas de disolución y liberación a lo largo del tiempo fueron casi idénticas (Fig. 2c). Estos hallazgos indicaron que las partículas se liberaron al mismo tiempo que la disociación local de PEG en el limo. Las nanopartículas contenidas en la baba de PEG se limitaron a la superficie de la úlcera después de la aplicación (Fig. 5b), lo que limitó la penetración desde el intersticio a los tejidos más profundos, lo que puede deberse a que la baba permaneció en la superficie de la úlcera más tiempo que el PBS. En otras palabras, a diferencia de los hidrogeles y las esponjas de PEG de tipo sólido, las partículas en el limo de PEG de tipo líquido se difundieron traslacionalmente27 y la infección por AAV se produjo predominantemente en la superficie de la úlcera donde se encontraba el limo de PEG (Fig. 7b).

El limo de PEG estaba más localizado durante la infección viral que el limo blando de PEG, que tenía una viscoelasticidad más baja, lo que resultó en una infección profunda predominantemente reducida usando limo de PEG (Fig. 3e). Debido a que las infecciones locales de la capa profunda fuera del objetivo estaban limitadas, la expresión fuera del objetivo en el hígado también disminuyó.

En informes anteriores, la terapia génica con vectores virales utilizando portadores ha resultado en una supresión de la tasa de liberación de vectores virales de los portadores. Por ejemplo, un lentivirus con un hidrogel y análogos prolongó la actividad local in vitro27 e in vivo28; un adenovirus transportado con fibrina tenía una mayor bioactividad y una vida media prolongada in situ29; y un AAV con gelatina tenía una concentración local aumentada de la sustancia bioactiva30.

El comportamiento de las nanopartículas de sílice en la superficie de las úlceras cutáneas con o sin portadores de PEG indicó la utilidad potencial de los portadores de PEG en la administración de otros tipos de fármacos y biomoléculas. La aclaración de otros comportamientos, como la dependencia de la dosis junto con la difusión dependiente del tiempo, la biodistribución y el aclaramiento de las sustancias administradas por vía subcutánea, debe realizarse en estudios futuros.

El limo de PEG podría aumentar la cantidad absoluta de partículas de AAV administradas en la capa superficial, aunque este aumento fue cancelado por la descomposición de los AAV dentro de PEG con el tiempo, lo que reduce la cantidad de células positivas en las capas más profundas, así como la cantidad total de células positivas. . Como consecuencia, el transportador tetra-PEG desarrollado en el presente estudio no mejoró significativamente la actividad local. La transducción de genes se localizó en la capa superficial de la piel y hubo una atenuación significativa de los efectos fuera del objetivo.

Hemos descrito una nueva tecnología para generar tejidos epiteliales expandibles a través de la reprogramación directa de células mesenquimales residentes en heridas, lo que permite que todas las regiones de la herida se vuelvan a epitelizar sin las limitaciones espaciales observadas durante la cicatrización normal9,10. La transducción de factores de reprogramación induce potencialmente la reprogramación directa de células no epiteliales a células epiteliales y, por lo tanto, la formación de tejidos epiteliales ectópicos en sitios distintos de la capa superficial de las úlceras cutáneas. Además, es deseable minimizar las reacciones adversas potenciales que el transgén puede inducir en órganos remotos.

En nuestro estudio inicial de prueba de concepto, no se detectaron reacciones adversas en el número limitado de animales pequeños. Sin embargo, se deben tomar todas las medidas posibles para el desarrollo posterior hacia aplicaciones clínicas. Consideramos que los hallazgos actuales podrían ser reveladores no solo para el desarrollo de la terapia génica para las úlceras cutáneas, sino también para cualquier tipo de desarrollo terapéutico que esté localizado y, por lo tanto, se espera que tenga efectos extremadamente poderosos.

Las otras limitaciones del estudio actual radican en las diferencias entre las estructuras de piel humana y de ratón31. Las principales diferencias incluyen el grosor de los componentes en capas, como la dermis y el tejido adiposo subcutáneo, la ausencia de glándulas sudoríparas en ratones y la presencia de la capa muscular delgada conocida como Panniculus carnosus en la piel de la espalda de los ratones. Es posible que estas diferencias no influyan sustancialmente en los hallazgos del estudio actual porque los experimentos se realizaron con la úlcera cutánea en una cámara de silicona. No obstante, se requiere una interpretación cuidadosa de los resultados durante las aplicaciones clínicas. La otra limitación radica en el modelo experimental. La administración de AAV líquidos en una cámara cerrada es completamente diferente de las administraciones reales en entornos clínicos, que implican la aplicación directa de la solución a la superficie abierta de la herida. El uso de líquidos viscoelásticos como portadores de AAV podría ser ventajoso para reducir la excreción de AAV32, aunque no se pudo determinar experimentalmente.

El uso de limo de PEG, que es un líquido muy viscoelástico, como vehículo para los AAV dio como resultado una expresión génica localizada en la capa superficial de la úlcera cutánea y redujo los efectos fuera del objetivo, en comparación con otros vehículos y un control de PBS. La liberación controlada usando el transportador PEG desarrollado en el presente estudio allana el camino para futuras terapias génicas localizadas.

El tetra-PEG-PA y el tetra-PEG-GS (Mw = 20 kg mol-1) (NOF Corporation, Japón) se usaron sin purificación adicional. Se usó poli(etilenglicol) funcionalizado con amina primaria (Mw = 20 kg mol−1) (tetra-PEG-NH2) (SINOPEG, China) sin purificación adicional. Sulfato de potasio (K2SO4), metanol superdeshidratado, sulfóxido de dimetilo superdeshidratado, GDL, FPBA, trietilamina (TEA), 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4- Se usaron n-hidrato de cloruro de metilmorfolinio (DMT-MM) y solución tampón de fosfato de paraformaldehído (PFA) al 4% (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Japón) sin purificación adicional. Alexa FluorTM 594 NHS éster (éster de succinimidilo) (Alexa-NHS) y solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) se usaron sin purificación adicional. Se preparó tampón de fosfato (pH 7,4; PB) a una concentración de 200 mM. RC15-AC (Sartorius, Alemania), ARVO™ X3 (PerkinElmer, EE. UU.) y LSM 800 (ZEISS, Alemania) se utilizaron como filtro de 0,22 μm, lector de microplacas y microscopio de barrido láser confocal (CLSM), respectivamente, en todos los experimentos. Se utilizó agua Milli-Q como agua durante todo el estudio.

Tetra-PEG-GDL y tetra-PEG-FPBA se sintetizaron acoplando las moléculas relevantes a tetra-PEG-NH2 según un informe anterior18. Para tetra-PEG-GDL, tetra-PEG-NH2 (1000 mg, 0,05 mmol), GDL (89 mg, 0,5 mmol, 10 equiv. de tetra-PEG-NH2) y TEA (50 mg, 0,5 mmol, 10 equiv. . de tetra-PEG-NH2) se disolvieron en 30 ml de metanol superdeshidratado. La mezcla se agitó y se incubó durante 3 días a 35 °C. Luego, la solución mixta se dializó contra el exceso de metanol y agua durante 24 h cada uno usando una membrana de diálisis Spectra/Por® (MWCO: 6000–8000 Da, Spectrum Laboratories, Grecia). La solución se filtró con un filtro de 0,45 µm y se liofilizó para obtener tetra-PEG-GDL (rendimiento: 900 mg). El polímero obtenido se caracterizó por 1H-NMR (Bruker Avance DPX-400 MHz, EE. UU.) utilizando D2O como disolvente.

Para la síntesis de tetra-PEG-FPBA, tetra-PEG-NH2 (1000 mg, 0,05 mmol), FPBA (91 mg, 0,5 mmol, 10 equiv. de tetra-PEG-NH2) y DMT-MM (138 mg, 0,5 mmol, 10 equivalentes de tetra-PEG-NH2) se disolvieron en 30 ml de metanol superdeshidratado. La mezcla se agitó y se incubó durante 3 días a 35 °C. A continuación, la solución mixta se dializó contra un exceso de HCl acuoso 10 mM, NaOH acuoso 10 mM, tampón fosfato (pH 7,4, 10 mM), NaCl acuoso 100 mM y agua destilada durante 24 h cada uno usando una membrana de diálisis. La solución se filtró con un filtro de 0,45 µm y se liofilizó para obtener tetra-PEG-GDL (rendimiento: 900 mg). El polímero obtenido se caracterizó por 1H-NMR utilizando D2O como disolvente.

Se prepararon hidrogel de PEG, esponja de PEG y limo de PEG disolviendo tetra-PEG mutuamente reticulables y mezclando los mismos volúmenes de tetra-PEG. Estos portadores de PEG se entrecruzaron usando los siguientes precursores. (1) hidrogel de PEG: tetra-PEG-PA y tetra-PEG-GS se disolvieron por separado en PB para dar la concentración de PEG (CPEG) = 60 g l−1. (2) Esponja de PEG: tetra-PEG-PA y tetra-PEG-GS se disolvieron por separado en PB con K2SO4 250 mM para obtener CPEG = 60 g l-1. (3) Baba de PEG: tetra-PEG-GDL y tetra-PEG-FPBA se disolvieron por separado en PB para obtener CPEG = 60 g l−1.

Se prepararon tetra-PEG-PA y tetra-PEG-GDL marcados con fluorescencia roja para visualizar la estructura interna de los andamios de PEG. Para tetra-PEG-PA, se disolvieron 1000 mg de tetra-PEG-PA en 20 ml de agua destilada y se agitó durante 10 min a temperatura ambiente. Por separado, se disolvió 1 mg de Alexa-NHS en 1 ml de sulfóxido de dimetilo superdeshidratado y se añadieron 16 µl (0,01 equiv. de tetra-PEG-PA) a la solución de tetra-PEG-PA. La solución mixta se incubó a temperatura ambiente durante 3 h, posteriormente se dializó contra un exceso de agua destilada durante 3 h para eliminar las moléculas que no reaccionaron y se liofilizó para obtener tetra-PEG-PA marcado parcialmente con fluorescencia roja, como un polvo rojo claro ( rendimiento: 950 mg). El tetra-PEG-PA y el tetra-PEG-GS marcados con fluorescencia roja se disolvieron en PB con concentraciones de K2SO4 = 0 y 300 mM para obtener CPEG = 60 g l-1. Estos dos precursores se mezclaron en el mismo volumen, se vertieron en un molde cilíndrico de silicona (diámetro: 5 mm y altura: 1 mm) y se incubaron a 25 °C durante 24 h. Las muestras obtenidas se observaron usando un CLSM.

Para la síntesis de tetra-PEG-GDL, antes de la reacción de GDL con tetra-PEG-NH2, se disolvieron 1000 mg de tetra-PEG-NH2 en 20 ml de metanol superdeshidratado. A continuación, se añadieron a la solución dieciséis microlitros (0,01 equiv. de tetra-PEG-NH2) de Alexa-NHS y la solución se incubó durante 24 ha temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron GDL y TEA a la solución mixta según el método descrito para la preparación de tetra-PEG-GDL. Luego se disolvieron tetra-PEG-GDL y tetra-PEG-FPBA marcados con fluorescencia roja en PB para obtener CPEG = 60 g l−1. Estos dos precursores se mezclaron en el mismo volumen, se vertieron en un molde cilíndrico de silicona y se incubaron a 25 °C durante 24 h, seguido de observación con un CLSM.

Se vertieron precursores de PEG marcados con fluorescencia roja para hidrogel de PEG y limo de PEG en un molde de silicona cilíndrico (diámetro: 5 mm y altura: 1 mm) y se incubaron a 25 °C durante 24 h. Bajo CLSM, los acarreos de PEG incubados se blanquearon con un círculo de 20 µm durante 1 s y se observó la recuperación de la intensidad de la fluorescencia.

Se diseñó un sistema modelo in vivo, utilizando una úlcera cutánea en la superficie de la espalda de ratones, con un inserto de cultivo celular de 12 pocillos (tamaño de poro de 8,0 µm) (Becton, Dickinson and Company, EE. UU.), que se colocó en un 12 -placa de cultivo de pocillos, y se evaluó la cinética de disolución o el comportamiento de liberación usando este sistema. Para la cinética de disolución, se prepararon en el inserto 100 µl de un armazón de PEG marcado parcialmente con fluorescencia roja al final de la molécula de PEG y se incubó a 25 °C durante 24 h. Luego, se agregaron 1000 y 2500 µl de DPBS al inserto y a la placa de pocillos, respectivamente. A temperatura ambiente en la oscuridad, se recogió una muestra de 2500 µl de la placa de pocillos para evaluar la concentración de sustancias permeadas en cada punto de tiempo. Después de muestrear la solución, se añadió un volumen similar de DPBS fresco a la placa de pocillos para mantener el volumen. La concentración de las muestras permeadas se determinó midiendo la intensidad de la fluorescencia (λex = 580 nm, λem = 590 nm) utilizando un lector de microplacas. La tasa de disolución se evaluó como un porcentaje en comparación con la cantidad total de tetra-PEG marcado con fluorescencia roja.

Para investigar el comportamiento de liberación de un virus modelo, se suspendió una solución de nanopartículas de sílice (1 mg ml−1, sicastar®-green F, diámetro de 30 nm, Micromod Partikeltechnologies, Alemania) en cada solución precursora de tetra-PEG-GDL. para limo de PEG y tetra-PEG-PA para hidrogel o esponja de PEG a una concentración de 0,1 mg ml−1 y CPEG = 60 g l−1. La solución mixta se añadió a los precursores de PEG para preparar portadores de PEG que contenían nanopartículas. El comportamiento de liberación de las nanopartículas se evaluó según el método descrito para la disolución de portadores de PEG, excepto por la medida de la intensidad de fluorescencia (λex = 460 nm, λem = 480 nm).

La prueba de relajación de tensión para la esponja PEG se realizó utilizando el aparato de compresión Rheogel-E4000 (UBM, Japón) para las muestras cilíndricas (diámetro: 15 mm, altura: 7 mm) a 25 °C. Después de la imposición de una pequeña deformación (ε = 0,5), se observó el decaimiento de la tensión en función del tiempo. La relajación del módulo de Young [E(t)] se calculó como la tensión dividida por la deformación aplicada. Para hidrogel de PEG y limo de PEG, las mediciones viscoelásticas dinámicas se realizaron utilizando un reómetro controlado por tensión (MCR301; Anton Paar, Graz, Austria) con un accesorio de placa paralela con un diámetro de 25 mm. La dependencia de la frecuencia angular (0,1–100 rad s−1) de los módulos de almacenamiento (G′) y pérdida (G′′) se midió a 25 °C. Las amplitudes de la tensión de cizalla oscilatoria se confirmaron dentro del rango de la viscoelasticidad lineal para todas las pruebas. Convertimos los datos de G′ y G′′ a E(t), asumiendo la deformación isovolumétrica (E = 3G).

Para generar los AAV, se prepararon plásmidos de AAVDJ, pAAV-GFPNLS, pAAV-mCherryNLS, pAAV-DNP63A y pAD5 y se transfectaron en 293AAV subconfluente cultivado, usando el método de cloruro de cesio10. El plásmido GFPNLS y mCherryNLS contenía la secuencia de señales de localización nuclear (NLS) y la secuencia del elemento regulador postranscripcional de la hepatitis de la marmota. El número de copias del gen se cuantificó mediante qPCR. Las secuencias de los cebadores que se utilizaron fueron las siguientes: AAV-ITR (Fw: GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT; Rv: CGGCCTCAGTGAGCGA).

El virus AAV se diluyó en PBS para hacer 5 × 1010 copias del gen (GC) en 5 µl. Se mezclaron aproximadamente 5 µl de solución de AAV preparada en 45 µl de tetra-PEG-GDL para PEG en limo y tetra-PEG-PA para PEG en hidrogel o esponja hasta CPEG = 60 g l−1, y la solución mixta se agregó a 50 µl de 60 g l-1 de precursores de PEG para preparar portadores de PEG que contengan AAV para obtener CPEG = 60 g l-1. Debido a que la baba de PEG se endurece inmediatamente después de mezclarla, la baba se transformó en gránulos de partículas con una base de 1 × 1 cm y un tamaño que coincidía con la base de la úlcera. Para un control, se mezclaron 5 ul de PBS que contenían 5 × 1010 GC de virus AAV en 95 ul de PBS.

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 de cuatro semanas de edad de Nippon Bio-Supp (Japón). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Tokio. Las cámaras hechas de silicio fueron sintetizadas por una impresora 3D20. Brevemente, se hizo un molde de una cámara de silicio en forma de tapa con un reborde de 5 mm de ancho utilizando una impresora 3D, y se vertió silicio en la cámara mezclando dos líquidos. La cámara de silicio sintetizado se esterilizó en autoclave.

El método de unión se basó en el método que hemos informado anteriormente para un ensayo de reconstrucción del cabello de la ulceración de la piel20. Se eligió el área interescapular para el sitio de fijación de la cámara debido a la alta estabilidad de la fijación de la cámara y la eficacia en el mantenimiento de la superficie de la úlcera a lo largo del tiempo. Bajo anestesia general con isoflurano, se rasuró minuciosamente el sitio de unión de la cámara. Se extirparon quirúrgicamente áreas circulares (1 cm de diámetro) de la piel y el tejido subcutáneo debajo del panículo carnoso. Se insertó la cámara y se suturó el borde y la piel suprayacente en 4 posiciones usando 5-0 Ethilon® (Johnson and Johnson, EE. UU.).

Las formulaciones de hidrogel de PEG y de esponja de PEG se administraron mediante goteo directo del componente líquido sobre la superficie de la úlcera cutánea antes de que el líquido se endureciera, a través de una pequeña incisión practicada cerca de la parte superior de la cámara de silicona. Después de la administración de la mezcla, la anestesia por inhalación se continuó en posición prona durante 5 minutos, y la inhalación del anestésico se terminó después de confirmar la curación en la superficie de la úlcera. También se administró PBS que contenía AAV, el grupo de control, de la misma manera, dejando caer el líquido directamente sobre la superficie de la úlcera cutánea en la cámara. La baba de PEG se administró de manera diferente a los otros materiales porque era lo suficientemente dura como para agarrarla directamente con fórceps. La cámara de silicona se abrió 3/4 de su recorrido y la baba se aplicó directamente sobre la superficie de la úlcera. Después de la administración, se suturó el centro de la abertura de la cámara con una sola puntada de nailon 5-0 para mantener un sellado hermético y evitar que se secara la superficie de la úlcera.

Los ratones se sacrificaron mediante dislocación vertebral cervical después de anestesia por inhalación, se abrió la cámara y se observó la parte posterior de la cámara inmediatamente después del procesamiento usando un estereomicroscopio (Axio Zoom®, Carl Zeiss, EE. UU.). El tejido de la piel, incluida la cámara de silicona, se recogió cuidadosamente hasta justo por encima de la pared torácica, incluida la capa muscular de la línea media de la espalda, se fijó durante la noche en PFA al 4 % y se colocó durante la noche en sacarosa al 30 %. Las muestras que contenían la superficie de la úlcera fija se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT Compound®, Sakura Finetek, JAPÓN) y se prepararon muestras congeladas. Las secciones se prepararon como rebanadas de 12 µm utilizando un criostato, se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en medio de montaje 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Fluoromount-G® con DAPI, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) y observado para la fluorescencia. La tinción con hematoxilina y eosina (HE) se realizó con técnica general10.

A partir de las imágenes tomadas con un estereomicroscopio en modo Axiozoom Z-stack, se utilizó el corte con el borde más claramente discernible de células infectadas. Para cada espécimen, se seleccionaron al azar cinco áreas (20 µm cuadrados) con foco. El número de celdas en el cuadro se contó visualmente y se calculó el valor medio. El número aproximado se calculó según el área de la superficie de la úlcera. Se extrajeron tres secciones obtenidas de tres ubicaciones generalmente distribuidas uniformemente para cada muestra. Usando los resultados de la tinción con HE de las secciones adyacentes, el número de partículas fluorescentes o células positivas se contó visualmente con un campo de visión de aumento de ×40, dividido por encima y por debajo del tejido adiposo y las capas musculares.

Para analizar los títulos de AAV en busca de efectos secundarios en el hígado, se recolectaron muestras de seis lóbulos y se extrajo ADN genómico utilizando un kit comercial (DNeasy® Blood & Sample Kit, QIAGEN, Alemania). El número de copias del genoma de AAV se midió en 100 ng de ADN genómico utilizando qPCR en un sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Los cebadores utilizaron la secuencia del genoma viral específicamente para AAV-ITR (Fw: GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT; Rv: CGGCCTCAGTGAGCGA) y el gen de la titina de ratón (Fw: CTCCATCACTAGGGGTTCCT; Rv: TTCAGTCATGCTGCTAGCGC). El número de copias de los genomas de AAV se expresó como un valor absoluto por núcleo diploide. Todas las muestras de ADN genómico se analizaron por triplicado.

DNP63A-AAVDJ (1 × 1012 GC) se marcó utilizando un kit de etiquetado de proteínas disponible comercialmente (Kit de etiquetado de proteínas Alexa Fluor® 568, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante3.

Se recogieron almohadillas de grasa subcutáneas de la ingle y la madera de ratones sacrificados de 3 a 5 semanas de edad. El tejido adiposo se digirió enzimáticamente10 y la fracción vascular del estroma se aisló mediante centrifugación, se inoculó en una placa de 6 pocillos recubierta de gelatina utilizando un pocillo para cada muestra de ratón y se mantuvo en medio de crecimiento DMEM completo que consistía en DMEM (que contenía 4,5 g l-1 de glucosa , 110 mg l−1 de piruvato de sodio y L-glutamina 4 mM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v), solución de aminoácidos no esenciales MEM 1:100 (v/v) (Gibco) , y suplemento GlutaMAX 1:100 (v/v) (Gibco).

Las mASC primarias P3 se gotearon en un portaobjetos colocado en una placa de cultivo celular, con 5 × 104 células en 200 μl de medio de crecimiento DMEM completo. Luego de 1 h de incubación a 37 °C, se agregó el medio a la placa hasta la dosis regular de cultivo celular. Después de 24 h de incubación, se colocaron en la placa MOI 2000 (GC por células) de AAV marcados. Después de 1 h de incubación a 4 °C, la célula adherida al cubreobjetos se recolectó minuciosamente y luego se montó con tinción DAPI para evaluarla bajo un microscopio confocal.

Se mezclaron AAV marcados (1 × 1010 GC por ratón) y nanopartículas de sílice (dosis final; dilución 20 veces) en 100 μl de PBS y se administraron a la úlcera de los ratones en la cámara. Las úlceras fueron recolectadas 24 h después para observación histológica.

Las mASC primarias P3 se sembraron en una placa de 24 pocillos (área base 1,9 cm2) con 1 × 104 células en cada pocillo. Después de 24 h de incubación, a las células se les administró GFPNLS-AAVDJ. GFPNLS-AAVDJ se incubó a 37 °C con o sin suero sanguíneo de ratón (purificado con tubo de suero BD Microtainer® con gel separador) durante un período determinado (0–24 h) y luego se administró a mASC. El medio de cultivo se renovó 24 h después de la administración de AAV. Las células positivas para GFP se contaron 72 h desde la infección en pocillos cuadruplicados.

Se utilizó el software Excel (Microsoft, EE. UU.) para evaluar la significación estadística. Para determinar la significación entre dos grupos, se aplicaron las pruebas t de Student de dos colas no apareadas. p ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se supuso que la distribución de datos era normal. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra, pero nuestros tamaños de muestra fueron similares a los informados en una publicación anterior10. La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen para los gráficos y tablas de las figuras están disponibles como Datos complementarios y cualquier información restante se puede obtener del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los materiales están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Este trabajo fue apoyado por los números de subvención JSPS KAKENHI JP20H03847 (para MK); Subvención JSPS KAKENHI para investigación desafiante (pionero) (JP20K20609) (para MK); Subvención JSPS KAKENHI para investigación científica (A) (JP21H04688) (a TS); Subvención en ayuda para áreas de investigación transformadora (JP20H05733) (a TS); Subvenciones de ayuda para JSPS Fellows (21J10828) (a MK); Becas de ayuda para becarios JSPS (JP20J01344) (a SI); Subvenciones de ayuda para científicos principiantes (JP20K15338) (a TK); Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST) CREST con el número de concesión JPMJCR1992 (a TS); y AMED con el número de concesión JP21zf0127002 (para MO, TS y MK). Victoria Muir, PhD, de Edanz (https://jp.edanz.com/ac) editó un borrador de este manuscrito.

Estos autores contribuyeron por igual: Motoi Kato, Shohei Ishikawa.

Departamento de Cirugía Plástica y Reconstructiva, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokio, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, Japón

Motoi Kato, Qi Shen, Zening Du, Takao Numahata, Mutsumi Okazaki y Masakazu Kurita

Departamento de Bioingeniería, Escuela de Ingeniería, Universidad de Tokio, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, Japón

Shohei Ishikawa, Takuya Katashima y Takamasa Sakai

Centro de Biología de Enfermedades y Medicina Integrativa, Facultad de Medicina de la Universidad de Tokio, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokio, Japón

mitsuru naito

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TS y M. Kurita diseñaron el estudio. M. Kato y SI diseñaron los experimentos. M. Kato, SI, TK y TN realizaron la adquisición o el análisis de datos. QS, ZD, TN y M. Kurita crearon AAV. Los polímeros fueron sintetizados por TK y MNM Kato, SI, TK, TS y M. Kurita redactó el manuscrito. Las tareas administrativas, técnicas o de supervisión estuvieron a cargo de MO, TS y M. Kurita.

Correspondencia a Takamasa Sakai o Masakazu Kurita.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Dan Wang, Navneet Matharu y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Huan Bao, Eve Rogers y Anam Akhtar. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Kato, M., Ishikawa, S., Shen, Q. et al. Portador de poli(etilenglicol) reticulado dinámico, moldeable in situ para la infección por virus adenoasociada localizada y efectos secundarios reducidos. Commun Biol 6, 508 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

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Recibido: 14 junio 2022

Aceptado: 19 de abril de 2023

Publicado: 16 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

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